Další snahy oživit myšlenku průplavu přišly na začátku 20. století z USA. Za počáteční částku 10 miliónů dolarů a 250 000 za každý další rok získali Američané souhlas vlády nově vzniklého státu Panamy s pokračováním prací. Za zajištění zdravotnické péče, což bylo jednou z nejdůležitějších podmínek projektu, byl odpovědný lékař plukovník William Gorgas. Stavitelem byl jmenován John Frank Stevens, později. George Goethals. Dále je třeba přiznat velké zásluhy za uskutečnění stavby tehdejšímu prezidentu USA Theodoru Rooseveltovi. Lesseps se snažil budovat kanál na úrovni moře, zatímco Američané uskutečňovali myšlenku série komor, kde je možno lodě zvedat a spouštět.


Nejhorším úsekem stavby byl třináctikilometrový průkop mezi Bas Obispo a Pedro Miguel. Pracovalo zde 6 000 dělníků za pomoci parních rypadel a výbušnin. Při této náročné a nebezpečné práci zde mnoho dělníků zahynulo a uvádí se, že zde bylo spotřebováno 27 694 tun dynamitu, což představovalo množství, převyšující spotřebu výbušnin ve všech válkách, které do té doby USA vedly. Navíc docházelo k častému zřícení stěn v důsledku nepevnosti skály. Obdivuhodným dílem je kaskáda plavebních komor na obou koncích. Budovy i velmi přesné strojní zařízení se stavěly z obou konců současně a výstavba trvala 4 roky. Vrata jsou postavená z betonu, který se lil do dřevěných forem obrovských rozměrů. Podlaha každé komory má tloušťku 4 - 6 m a stěny u podlahy jsou široké až 15 m. Nahoru se zužují až na 2,5 m. Komor je celkem 12 a bylo na ně spotřebováno 3 360 000 krychlových metrů betonu. Voda pro vyrovnávací komory se bere z jezer Gatún a Miraflores. Odtud proudí voda na dno komory a zvedá tak lodě. Opačným způsobem se lodě spouští. Proudění vody se reguluje ocelovými vraty uloženými na kuličkových ložiscích.


Průtok vody z Gatúnu se rovněž využívá k výrobě elektrické energie, která pohání veškerá zařízení, např. stavidla, vrata a lokomotivy, sloužící k tahání lodí. Lodě nesmí proplouvat vlastním pohonem vzhledem k možnosti havárie. Na koncích komor jsou vrata o hmotnosti několika set tun. Tato se otvírají do tvaru písmene V a jsou konstruována tak, aby panty byly minimálně namáhány. Vrata jsou tlustá 2 m. Největší vrata jsou vysoká 25 m a mají hmotnost 756 tun. Celý provoz kanálu může ovládat jeden člověk z kontrolního panelu. Obsluhu průplavu ale zajišťuje 7500 operátorů. Průplav je otevřen nepřetržitě. Během své existence byl uzavřen pouze jednou, na 7 měsíců po masivním sesuvu půdy v roce 1915 na úseku zvaném Culebra. První loď proplula Panamským průplavem roku 1914. Po deseti letech od otevření průplavu tudy proplouvalo asi 5 000 lodí ročně, v 70. letech činil provoz 15 000 lodí za rok. Obchodním lodím byl však kanál zpřístupněn až v roce 1920. Každý rok se průplavem převeze 190 milionů tun nákladu, poplatky za proplutí představují ročně 470 milionů dolarů. Cesta průplavem trvá 8 - 10 hodin, kvůli čekání se ale prodlužuje průměrně na 24 hodin. Denně tu propluje asi 48 lodí. Výstavba průplavu stála téměř 400 milionů dolarů.